Widok zawartości stron
PAKIETY ROBOCZE
Spektrometria mas stała się znaczącą techniką w badaniach biologicznych do identyfikacji, charakteryzowania i oznaczania ilościowego białek. W ramach pierwszego pakietu roboczego wdrożone zostaną metody spektrometrii mas w celu identyfikacji i ilościowej oceny peptydów pochodzących z P. gingivalis w różnych próbkach tkanek (krew, mózg, dziąsła, płyn mózgowy).
Inhibitory pgQC zostaną scharakteryzowane in vitro, a następnie wybrane związki zostaną przetestowane in vivo na modelu mysim. Efekt leczenia inhibitorami pgQC zostanie oceniony w badaniach behawioralnych. Drugi pakiet roboczy będzie realizowany przez grupę badawczą z dziedziny Biotechnologii Molekularnej kierowaną przez Holgera Cynisa w Instytucie Terapii Komórkowej i Immunologii im. Fraunhofera (IZI-MWT) w Halle w Niemczech. Grupa ta jest odpowiedzialna za przeprowadzenie ogólnych badań przedklinicznych in vitro oraz in vivo inhibitorów pgQC.
Wykrywanie bakterii w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) przy użyciu obecnie dostępnych metod hodowlanych lub opartych na technice PCR wymaga wysoce inwazyjnej i niebezpiecznej procedury, jaką jest biopsja mózgu. W związku z powyższym, w ramach projektu, Partner 3 opracuje zestaw narzędzi chemicznych służących do identyfikacji, wizualizacji i oceny ilościowej gingipain. Jako pierwsza skonstruowana zostanie wysoce swoista i ultraczuła sonda diagnostyczna oparta na technologii DIANA umożliwiająca wykrywanie gingipain. Następnie opracowane zostaną specyficzne koniugaty polimerowe połączone z inhibitorami gingipain, umożliwiające obrazowanie i potencjalnie leczenie zapalenia wywołanego przez P. gingivalis. Narzędzia te zostaną zaprojektowane w oparciu o struktury znanych specyficznych inhibitorów gingipain.
W celu wywołania zapalenia przyzębia u myszy zostanie wykorzystany model doustnej infekcji P. gingivalis. Utrata kości wyrostka zębodołowego w odpowiedzi na zakażenie P. gingivalis zostanie określona za pomocą tomografii mikrokomputerowej (µCT). Dyseminacja P. gingivalis do OUN będzie analizowana w tkankach mózgowych uzyskanych post-in vivo przy użyciu metody qRT-PCR. Przeprowadzona zostanie również dodatkowa analiza w celu wykazania obecności anionowego LPS pochodzącego z P. gingivalis (A-LPS) i antygenu gingipain w strukturach mózgu metodami immunohistochemii, immunofluorescencji i mikroskopii konfokalnej. Wpływ infekcji P. gingivalis na powstawanie zmian neurodegeneracyjnych zostanie określony na podstawie charakterystyki fenotypowej komórek glejowych (mikrogleju i astrocytów) oraz akumulacji złogów β-amyloidu.
W ramach piątego pakietu roboczego zbadana zostanie zdolność inhibitorów pgQC do zapobiegania spadkowi funkcji poznawczych u myszy infekowanych P. gingivalis. Ponadto, najnowocześniejszy system obrazowania Hyperion zostanie wykorzystany do opracowania nowatorskiego podejścia do analizy tkanki mózgowej. System ten łączy precyzyjnie skierowany laser do zbierania próbek biologicznych barwionych przeciwciałami znakowanymi metalami i analizowania ich przy użyciu technologii CyTOF pozwalającej na jednoczesne badanie szerokiego panelu markerów białkowych. Tkanki mózgowe myszy będą analizowane w rozdzielczości subkomórkowej, przy jednoczesnym zachowaniu informacji o architekturze tkanki i morfologii komórkowej, co pozwoli odkryć nowe korelacje biomarkerów i interakcje komórkowe. Zdobyta wiedza umożliwi opracowanie nowego modelu etiopatogenezy AD opartego na skutkach zakażenia P. gingivalis i może otworzyć drogę do opracowania nowych biomarkerów oraz metod diagnostycznych tej choroby.